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Isocyanatpräcursoren - ein Ansatz für neue Zytostatica ? 
 

Sehr geehrter Herr Professor Hildebrandt,

sehr geehrte Kommissionsmitglieder,

meine sehr geehrten Damen und Herren!
 

Einen umfassenden Vortrag über unser Gebiet, daß wir seit 1982 bearbeitet in der zur Verfügung stehenden Zeit zu halten, ist nicht möglich. Ich werde mich daher auf einen Überblick mit einigen, wie ich glaube, pharmazeutisch interessanten Einzelfragen beschränken. Wir beschäftigen uns mit Harnstoffderivaten mit transacylierende Eigenschaften, von denen wir biologische Wirkungen erhoffen. Dabei haben wir u.a. insektzide Wirkstoffe gefunden. Heute möchte ich aber nur über Produkte mit Einfluß auf die Zellteilung sprechen. Unsere Ausgangshypothese leitet sich von der bekannten Tatsache ab, daß Isocyanate als hochreaktive Heteroallene mit nucleophilen Gruppen in biologisch wichtigen Molekülen stabile Addukte bilden können. Damit sind häufig pharmakologische Effekte, oft toxischer Art verbunden. Isocyante sind somit als germicide Stoffe potentiell geeignet. Voraussetzung für eine Anwendung ist aber zumindest die Abschwächung ihrer toxischen Wirkungen.

Dia . [Transportform 1.ter u. 2.ter Art] 1

Ein möglicher Weg ist, den Wirkstoff in eine untoxische Transportform einzubauen, aus der die Wirkform möglichst erst am Zielort freigesetzt wird. Arzneistoffe dieses Typs werden nach Kreutzkamp ⁽¹⁾ als "Transportformen erster Art" bezeichnet.

Problematisch ist jedoch die Möglichkeit unerwünschter Freisetzung an anderen Orten als dem Wirkort wie sie durch ubiquitäre chemische oder biologische Vorgänge ⁽²⁾ möglich ist. Dieses Risiko kann durch den Einsatz einer "Transportform zweiter Art", die den Wirkteil direkt aus dem Transportmolekül auf den Rezeptor überträgt, vermindert werden. Ziel unserer Arbeit ist das Auffinden geeigneter Transportformen für Isocyanate, die selektiv mit bestimmten Nucleophilen reagieren können, ohne daß intermediär freies Isocyanat auftritt. Angriffspunkte derartiger Isocyanatpräcursoren sind die NH-Funktionen der Aminosäuren, deren Funktionalität durch eine Übertragung des Carbamoylrests gehemmt werden soll. Acylierungsreaktionen werden bei chemotherapeutisch eingesetzten Stoffklassen umfangreich als Wirkprinzip genutzt. Beispielsweise weiß man von den ß-Lactamen, daß sie in der Kaskade der Zellwandbiosynthese der Bakterien die Transpeptidase des letzten verknüpfenden Schritts der Peptidoglycan-Synthese durch Acylierung inaktivieren.

 
Dia [2]. [Computervergleich] 2
 

Vermutlich erfolgt dies durch die Konformationsähnlichkeit des den ß-Lactamen zugrunde liegenden Dipeptids aus D-Cystein und D-Valin und dem eigentlichen Substrat der Transpeptidase, einem Peptid mit der Teilstruktur des D-Alanyl-D-alanin.

Hier in der Struktursimulation am Computer ⁽³⁾ wird dies meines Erachtens recht anschaulich. Dargestellt sind die Moleküle mit ihren v.d. Waalsradien in üblicher Farbkodierung. Verglichen mit der schwer steuerbaren Bioreaktivität der in der Tumortherapie eingesetzten alkylierenden Zytostatika liegt unseres Erachtens ein Vorteil einer Carbamoylierung in der Reversibilität der Reaktion. Zum Beispiel durch Hydrolyse oder Nutzung der Enzymkaskaden des Harnstoffzyklus.
 

Dia. [Carmustin Wirkmech.] 3
 

Eine uns leitende Struktur war der in der Tumortherapie eingeführte N-Nitrosoharnstoff Carmustinⁱ (Carmubris^R). Während in älterer Literatur ⁽⁴⁾ stets dem durch Hydrolyse entstehenden "alkylierenden Carbeniumion" die zentrale Rolle zugesprochen wurde, wird heute auch eine Acylierungsreaktion durch das ebenfalls bei der Hydrolyse entstehende 2-Chlorethylisocyanat angenommen ⁽⁵⁾.  

Bemerkenswerterweise zeigen andere N-Nitrosoharnstoffe, die kein Isocyanat bilden können, keine oder nur eine geringere zytostatische Aktivität ⁽⁶⁾.
 

Dia [8]. [Arzneistoffbeispiele] 4
 

Als Transportformen für Isocyanate schienen uns Harnstoffderivate besonders geeignet zu sein, da Harnstoffe augenscheinlich zu den biologisch tolerierbaren Strukturen gehören. In gängigen Lehrbücher und in zusammenfassenden Artikeln ⁽⁷⁾ werden Harnstoffderivate mit anaesthetischer, pesticider, antidiabetischer, antidepressiver, antituberkulöser, hypoglykämischer, antikonvulsiver, antineoplastischer und hypnotischer Wirkung sowie als Pflanzenschutz- und Schädlingsbekämpfungsmittel beschrieben. Biogene Verbindungen wie Purin- und Pyrimidinderivate vervollständigen das Bild. Es sprengte diesen Vortrag, alle Anwendungen mit Strukturbeispielen zu belegen. Mit diesen, zum Teil in Heterocyclen eingebundenen Harnstoffstrukturen möchte ich Ihnen nur zeigen, wie vielfältige alleine die Anwendungen als Chemotherapeutica sind ⁽⁸⁾.
 

Dia [11]. [Darstellungswege] 5
 

Die ersten von uns eingehend untersuchten Verbindungen, die N-substituierten, N'-acylierten Harnstoffen, sind als Stoffklasse schon seit über 100 Jahren bekannt ⁽⁹⁾. Die Darstellung erfolgte meist durch Zusammenschmelzen der Ausgangsstoffe, Erhitzen von Amiden in flüssigen Isocyanaten oder Umsetzung beider Komponenten in hochsiedenden Lösungsmitteln ⁽¹⁰⁾. Wir nutzen als Hauptzugangsweg die Umsetzung von Säureamiden mit Isocyanaten in trockenem Dioxan unter Rückfluß, meist mit befriedigenden bis guten Ausbeuten.
 

Dia [14].[Hauptspaltwege] 6
 

Schon bei ersten Spaltungsversuchen mit Aminen als Modellnucleophilen zeigte sich, daß die beiden prinzipiell denkbaren Spaltungswege zu Isocyanaten und Acylisocyanaten zur Beschreibung des wesentlich komplexeren Spaltungsverhaltens nicht ausreichten. Neben den Hauptreaktionswegen A und B können eine Reihe von "Nebenwegen" auftreten. Nebenwege bedeutet hierbei nicht Nebenprodukte, die Produkte sind Haupt- oder einziges Reaktionsprodukt. Aus Zeitgründen will ich aber auf diese Nebenwege nicht eingehen ⁽¹¹⁾. Um diese Einflüsse abzuklären, wurden zahlreich verschieden substituierte Verbindungen hergestellt, das Zeigen entsprechender langer Tabellen möchte ich Ihnen jedoch hier und auch im Folgenden ersparen.

Diese wurden dann in Spaltungsuntersuchungen in ihrem Verhalten gegen verschiedene Nucleophile getestet. Um die Zahl der sich ändernden Parameter nicht zu groß zu gestalten, wurden dazu "Standardbedingungen" bezüglich Lösungsmittel, Temperatur, Aufarbeitung usw. definiert und angewendet. Als in vitro Modellsubstanzen wurden CH- aciden Substanzen sowie OH-, SH- und NH- Nucleophile ⁽¹²⁾ verwendet. Die Selektivität der Spaltung war erfreulich hoch, Reaktionen traten üblicherweise ⁽¹³⁾ nur mit NH-Nucleophilen ein. Da die Effekte von Isocyanaten, wie erwähnt, wesentlich auf die Reaktion mit Aminogruppen von Biomolekülen zurückzuführen sind, ist hier eine wichtige Eigenschaft der "Wirkform" in der "Transportform" erhalten geblieben.
 

Dia [13]. [Spektrum 60 fach] 7
 

Ich möchte Ihnen unser IR-spektroskopisches Verfahren zur Reaktionsverfolgung während der Spaltungsuntersuchung erläutern.

Nach Aufnahme eines Bezugsspektrums wurden Testlösung und Lösungsmittelvergleich direkt aus dem Ansatz durch ein IR-Gerät ⁽¹⁴⁾ gepumpt ⁽¹⁵⁾ und im überlagerten Verfahren alle 5 bzw. 10 min ein Differenzspektrum aufgezeichnet. Um Rückreaktionen zu erkennen wurde das Erhitzen abgebrochen und bis zum Erkalten weiter registriert. Bei Ansätzen ohne Nucleophil konnte so durch das Fehlen einer entsprechenden Banden im IR Spektrum ein Zerfall durch thermische Dissoziation in freies Isocyanat und Amid und Erklärung des Spaltungsverhaltens durch Reaktion des ersteren mit den zugesetzten Aminen ausgeschlossen werden. 

Im Dia dargestellt ist eine 60 fach wiederholte Registrierung des Spektrums im 5 min Abstand. Es zeigt, daß die Verbindung über den gesamten Meßzeitraum stabil ist. Über verschiedene Stoffklassen, so N-substituierte Carboxamide, Lactame, N-Methyl- und
N-Phenyl-formamide, von denen es uns erstmals gelang sie mit Isocyanaten umzusetzen, Oxime bzw. Acylnitrone, die chemisch interessant Nebenbefunde ergaben, sich aber für unsere Hauptarbeitsrichtung aus verschiedenen Gründen als nicht geeignet erwiesen, kamen wir zu den Ketiminen ⁽¹⁶⁾.
 

Dia [23]. [Russen/Wir - Ketimin/Iso] 8
 

Aus dieser Stoffklasse waren bisher nur einige Diphenylmethylenharnstoffe hergestellt und von einer russischen Arbeitsgruppe ⁽¹⁷⁾ in Aminolyseuntersuchungen getestet worden. Als Ergebnis wurden Additionen an die Doppelbindung beschrieben. Wir haben diese Untersuchungen aufgegriffen und sowohl nach der Originalvorschrift ⁽¹⁸⁾, als auch mit unseren "Standardbedingungen" bei der Aminolyse in Ausbeuten von 80 - 100 % nur Produkte eines Isocyanatweges und keinAdditionsprodukt gefunden ⁽¹⁹⁾ , ⁽²⁰⁾.
 

Dia [25]. [Spektrum 3 Acylimin-Eniso] 9
 

N-Acyl-N'-alkylidenharnstoffe waren bisher noch nicht beschrieben worden. Wir konnten sie unter milden Bedingungen bei -15^oC in absolutem Tetrahydrofuran aus Ketiminen und Acylisocyanaten erhalten ⁽²¹⁾. Eine Besonderheit stellen in diesen Reihen Addukte zwischen Acylisocyanaten und Isopropylphenylketimin dar. Nach neueren Untersuchungen ⁽²²⁾ liegt letzteres in der Iminoform und nicht in einer denkbaren Enaminostruktur vor. Die Additionsprodukte mit Acylisocyanaten lagern sich aber nach ¹H-NMR- Unter-suchungen, das Auftreten der beiden isolierten Methylsignale ⁽²³⁾ beweist das Vorliegen der Verbindung in der Enaminoform, jedoch vollständig in diese um, wie es für derartige tautomeriefähige Systeme zu erwarten ist.
 

Dia [26].[Spaltung Acyliso-Ketimin] 10
 

In den Spaltungsuntersuchungen ergaben sie hingegen ausschließlich Produkte des Acylisocyanatweges, was eine Reaktion aus den Alkylidenharnstoff-Tautomeren gemäß dem gezeigten Schema nahelegt. Es wird zusätzlich dadurch gestützt, daß Produkte einer denkbaren En-Isocyanatspaltung nicht beobachtet wurden.
 

Dia [27]. [Imidate u. Isocy. + 13C-Methoxy] 11
 

Im weiteren wurden Umsetzungsprodukte von Imidaten und Isocyanaten hergestellt und untersucht. Im Gegensatz zur sonst breiten Bearbeitung der Imidate waren Umsetzungen mit Iso- und Acylisocyanaten bisher noch nicht vorgenommen worden ⁽²⁴⁾.

Imidate sind durch die bekannte "Pinner-Reaktion" ⁽²⁵⁾ als Hydrochloride meist gut erhältlich, die freien Basen hingegen sind nur kurzzeitig stabil. Wir stellten erstere daher nach einem literaturüblichen Verfahren ⁽²⁶⁾ her und setzten sie als Basen sofort nach der Freisetzung ohne Isolierung um ⁽²⁷⁾, ⁽²⁸⁾. Der notwendige Strukturbeweis für den Erhalt der Imidoesterpartialstruktur in den Umsetzungsprodukten, um das Eintreten einer Chapman-Umlagerung ⁽²⁹⁾, ⁽³⁰⁾ auszuschließen, läßt sich leicht durch das ¹³C-NMR führen. Der Peak für das O-CH₃ Signal 3 liegt bei etwa 55 ppm, in guter Übereinstimmung mit der Literatur, die für Methyl als
-Substituenten am Sauerstoff 50 - 60 ppm angibt. Ein entsprechender Peak für N-CH₃ wird mit maximal 48 ppm, meist um 35 ppm angegeben. Im unserem biologischen Standardtest, auf den ich noch zurückkomme, hatten sich die Isocyanatumsetzungsprodukte mit Ketiminen oder Imidaten als bis dato wirksamste Verbindungsklassen ⁽³¹⁾ erwiesen. Da beiden Stoffklassen die C=N-Doppelbindung am abzuspaltenden Molekülteil gemeinsam ist, suchen wir nach weiteren Iminokomponenten für die Umsetzung mit Isocyanaten. Wir haben dazu bisher Iminoimidazoline, Iminochinazoline, Amidine und Isoharnstoffe untersucht, von denen ich über Umsetzungen von Isoharnstoffen mit Isocyanaten berichten möchte.
 

Dia [33]. [O-Alkyl/O-Aryl- Isoharnst.] 12
 

O-Alkyl-isoharnstoffe können aus den entsprechend substituierten Cyanamiden und Alkoholen im Überschuß unter basischer ⁽³²⁾ Katalyse in glatter Reaktion erhalten werden ⁽³³⁾, ⁽³⁴⁾. Die aus unserer Sicht interessanteren O-Aryl-isoharnstoffe sind auf diesem Weg nicht zugänglich, da im Gegensatz zu den Alkoholaten die Phenolate nicht an Cyanamide addierbar sind. Ihre Darstellung erfolgt durch Umsetzung von Phenylcyanaten mit Aminen, im Falle aromatischer Amine mit deren Salzen ⁽³⁵⁾. Durch Variation der Reaktionspartner, einerseits im Cyanat ⁽³⁶⁾, anderseits in der Aminkomponente sind vielfältige Isoharnstoffe erhältlich. Es gelang uns dabei auch, durch Modifikation der Literaturvorschrift ⁽³⁷⁾ die bisher nicht darstellbaren N,N,O-Triphenylisoharnstoffe darzustellen ^(38).
 

Dia [34]. [Umsetzung mit Isocyanaten] 13
 

Die Umsetzungen mit Arylisocyanaten ergaben in Ausbeuten größer als 70 - 90 % die entsprechenden Addukte, während mit Acylisocyanaten nur die aus der Reaktion mit sich selbst erklärbaren N,N'-disubstituierten Harnstoffe entstanden. Setzt man jedoch bei -60 bis -30oC in absolutem Ether um, erhält man auch hier die gewünschten Produkte.
 

Dia [38]. [HNCO-Übertragung] 14
 

Eine chemisch interessante Reaktion trat bei der Umsetzung von N,N-Diethyl-O-phenyl-isoharnstoff mit Phenylisocyanat ein. Statt des erwarteten Carbamoylisoharnstoffes TH29 (links) erhielten wir bei Umsetzungen bei Raumtemperatur stets das um ein HNCO-Fragment reichere 2-Isotriuret TH24 (rechts). Die eigentlich Zielverbindung (TH29) erhielten wir erst durch Umsetzung in absolutem Ether bei -60⁰C.
 

Dia [39]. [Röntgenstruktur] 15 
 

Die Strukturaufklärung dieser, in Form sehr regelmäßig gebauter monokliner Kristalle vorliegenden Verbindung ⁽³⁹⁾, ⁽⁴⁰⁾, erfolgte mittels IR, NMR und der hier gezeigten Röntgenstrukturanalyse ^(41).
 

Dia [40]. [Reaktionsmechanismus 1.Teil] 16
 

Als Reaktionsmechanismus für die Bildung der Verbindungen nehmen wir einen viergliedrigen Übergangszustand an, aus dem beide Produkte durch Umlagerung, je nach thermischen Bedingungen, hervorgehen können. Bei - 60oC kommt es durch Protonenwanderung und Bindungsumlagerung zum Carbamoylisoharnstoff. Bei Raumtemperatur entsteht neben dem Hauptprodukt TH24 der Isoharnstoff, dessen Bildung sich ebenfalls durch Umlagerung aus dem Übergangszustand erklären läßt.
 

Dia [41]. [Reaktionsmechanismus 2.Teil] 17

Im weiteren Verlauf reagiert die entstandene Isocyansäure mit dem Phenylisocyanat zum Phenylcarbamoylisocyanat. Die anschliessende Additionsreaktion an den Isoharnstoff entspricht dem üblichen Reaktionsablauf. Temperaturabhäng aufgenommene 1H-NMR-Spektren legen durch die Änderung der chemischen Verschiebung der Protonen der Methyleno-Gruppen der Diethylamingruppe das Durchlaufen von zwei Übergangszuständen nahe ⁽⁴²⁾. Die Bildung des Isotriurets TH24 konnte durch unabhängige Gegensynthese bewiesen werden ⁽⁴³⁾, ⁽⁴⁴⁾, ⁽⁴⁵⁾. Hierbei wurde ein einfacher Zugang zu den bisher unbekannten 2-Isotriureten gefunden, den wir demnächst publizieren werden ⁽⁴⁶⁾. Im folgenden möchte ich über einen Teil unserer Bemühungen die biologische Wirkung der hergestellten Substanzen zu ermitteln, berichten.
 

Dia [32]. [Kressetest] 18
 

Als einfachen Test auf zellteilungsbiologische Aktivität verwendeten wir eine modifizierte Form des "Kresse-Wurzel-Test" nach Butula ⁽⁴⁷⁾, ⁽⁴⁸⁾. ^In diesem Test zeigten die vorstehenden Verbindungen zu unserer Überraschung bereits bei Konzentrationen im Bereich von 40 bis 60 ppm (0.05 mg/ml) im Gegensatz zu den Umsetzungsproduktem mit Ketiminen und Imidaten, die bisher unsere wirksamsten Strukturen waren, etwa zwei Zehnerpotenzen verdünnter, deutliche Wirkungen auf das Haarwurzelwachstum der Kresse. Dargestellt sehen Sie die Entwicklung der Wurzelhaare, links oben der in Wasser gezogene Vergleich, die übrigen Bilder zeigen verschiedene Versuchsansätze ⁽⁴⁹⁾, ⁽⁵⁰⁾. Umsetzungen mit Aminen ergaben bis 98% Spaltprodukte des erwarteten Isocyanatweges. Besonders bemerkenswert ist, das die Ergebnisse der Piperidinolyse mit den Ergebnissen im Kressetest korrelieren.
 

Bitte das letzte Dia [xx]. [N,O-Diaryliso, TH59, TH92] 19
 

Für ausreichende thermische Stabilität und hohe Nucleoselektivität ist eine O-Arylisoharnstoffstruktur notwendig, wie sie im oberen Teil des Dia zu sehen ist. Vergleichstestungen mit den als Ausgangsverbindungen eingesetzten Isoharnstoffen, die als Alkyl- und Arylantien selbst eine Hemmung auslösen könnten zeigen, daß diese das Wurzelhaarwachstum erst bei zwei Zehnerpotenzen höheren Konzentrationen beeinflussen. Die Verbindungen TH59 und TH92, im unteren Teil des Dia zu sehen, kommen einer optimalen Hemmwirkung des Haarwurzelwachstums und damit unserer Modellvorstellung sehr nahe. Wenn Sie nach der therapeutischen Relevants unserer Ergebnisse fragen, kann ich nur antworten, daß wir uns nach unserem Selbsverständnis Grundlagenforschung betreiben. Um aber zu zeigen, daß wir uns nicht völlig im akademischen Bereich bewegen, möchte ich Ihnen abschließen eine Folie über ein therapeutisch eingesetztes Arzneimittel zeigen.
 

(FOLIE) Abb. 20
 

Für den Isocyanatabspalter Lomustine konnte zwischenzeitlich gezeigt werden, daß das freigesetzte Isocyanat mit Lysinresten der DNA-Reparaturenzyme reagiert und so die Wirkung des Alkylants erhöht ⁽⁵¹⁾.
 

Meine sehr geehrten Damen und Herren, damit bin ich am Ende meines Vortages.
 

Abschließend bleibt mir nur noch meinen früheren und heutigen Mitarbeitern Frau Sabine Jürgens, Herrn Jörg Heuer und Herrn Dr. Thomas Höppner für ihre Mitarbeit zu danken und Ihnen danke ich für Ihre Aufmerksamkeit.
 
 
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Ggf. Ergänzung:

2. Folie

Für meine Arbeitsrichtung besonders wichtig erscheint mir das unter dem Versuchsnamen HO-221 bekannt gewordene Benzoylharnstoffderivat der Firma Ishihara Sangyo ⁽⁵²⁾. Diese Substanz ist mit bemerkenswerten Antitumoreigenschaften beschrieben. So soll sie z.B. keine Kreuzresistenz zu anderen Cytostatika aufweisen. Seit der Einführung der N-Nitrosoharnstoffe in die Chemotherapie wurden eine Reihe weiterer Derivate dargestellt. Aktuell befindet sich Cystemustin in Phase II der klinischen Prüfung.

 

1.	N. Kreutzkamp, Pharm.Ztg. 118 1103 (1971).
2.	Hydrolyse, Redoxvorgänge oder unspezifische Esterasen
3.	Programm MAD
4.	Roth / Fenner, "Arzneistoffe" (1988), S.185.
5.	Goodman / Gilman, The Pharmakological Basis of Therapeutis, 8. Auflage 1991, S.1212-1213.
6.	Kann, Kohn und Lyles in Cancer Res. 34, (2), 398 (1974): "The isocyanat seems to be important, since other N-nitroso- urea-compounds have little or no activity".
7.	M.O. Lozinskii u. P.S. Pel'kis, Russ. Chem. Rev. 37, 363 (1968).
8.	Wobei die Harnstoffpartialstruktur nur zum Teil Bestandteil der pharmakophoren Gruppen ist und z.T. nur "Hilfsfunktionen" zur Veränderung der Pharmakokinetik haben.
9.	A.W. Hofmann, Ber.Dtsch.Chem.Ges. 15, 407 (1882).
10.	Weitere Zugangswege: Umsetzung von Acylisocyanaten mit Aminen, die Acylierung von Harnstoffen sowie ein modifizierter Hofmann-Abbau.
11.	Als Ausweichreaktionen (Weg e) treten bei geeignet konstruierten Verbindungen Substitutionen (Halogen) oder Additionen (Doppelbindung) im Rest R1 auf. Im Falle entsprechender aliphatischer Reste R2 ist dies die einzige zu beobachtende Reaktion. Bei ausreichender NH-Acidität werden auch Salzbildungen (Weg d) mit den zur Spaltung gedachten Aminen beobachtet. Wenn es sich beim Acylrest um einen Formylrest handelt, wird nur eine Abspaltung (Weg a) oder Übertragung (Weg b) des Acylrestes auf das Amin beobachtet. Eine ungewöhnliche Ausweichreaktion ,die zwar in einem Einzelfallbeliebig wiederholbar ist, von der es uns jedoch nicht gelang, sie auf andere Beispiele zu übertragen, ist Weg c.
12.	Dimedon, Alkohole, Thiophenol, Benzylmercaptan sowie ver schiedene Amine (Cyclohexylamin, Benzylamin, Piperidin).
13.	Ausnahmen z.B. bei thermisch-zerzetzlichen Produkten.
14.	Beckman MikrolabR 600 IR.
15.	ISMATEC Mikroliterpumpe, Fluß 6-10 l/min.
16.	Ihrerseits über Grignardreaktion darstellbar.
17.	B.S. Drach / J.Y. Dolgushina / A.D. Sinitsa / A.V. Kirisanov,  Zh.Obs.Khim. 42, 1240 (1972).
18.	Mit Aminen in Benzol bei RT
19.	Die säulenchromatographisch bestimmten Substanzwiederfin dungsraten waren größer als 80 - 90 %, das Spaltungsverhalten wie erwartet.
20.	Ein unterschiedliches Spaltungsverhalten durch den Wechsel von primärem zu sekundärem Amin war nicht zu beobachten. Ohne Aminzusatz und gegen andere Nucleophile waren die Sub stanzen stabil.
21.	In den Spaltungsuntersuchungen erwiesen sie sich in Ab wesenheit von Nucleophilen, auch bei in-situ-IR-Untersuchun gen, als stabil. Mit Aminen gaben sie, wie erwartet, in Aus beuten über 80 - 99 % die Produkte eines Acylisocyanatweges.
22.	Th. Kibbel, Diss. Hamburg 1986.
23.	Bei 1,85 und 1,97 ppm im 400 MHz.
24.	Anmerk. zu A. Pinner, Ber. 23, 2923 (1890) im Houben-Weyl ist falsch.
25.	Nitril-Alkohol-gasf. HCl
26.	B.L. Zakharov, Zh.Org.Khim. 8, 31 (1972).
27.	Die Reaktion in Tetrahydrofuran bei -15oC verläuft erstaun lich glatt, wobei die Ausbeuten größer 40% - 90% waren.
28.	In den anschließenden Spaltungsuntersuchungen erwiesen sich die Verbindungen in Abwesenheit von Nucleophilen wie erhofft als stabil, mit Aminen ergaben sie in guten Ausbeuten die Produkte eines Isocyanatweges.
29.	Umlagerung zum N,N-disubstituierten Amid.
30.	R.Roger u. D.G.Neilson, Chem.Rev. 61, 190 (1961).
31.	H.G. Schweim, Die Pharmazie, 44, 319 (1989).
32.	oder saurer
33.	a) O-Alkylisoharnstoffe: E. Forman u.a., J.Org.Chem. 28, 2653 (1963); b) O-Arylisoharnstoffe: E. Griget / R. Pötter, Chem. Ber. 97, 3027 (1964).
34.	Steglitz / McKee, a) Ber. 32, 1494 (1899);                            b) Am.Chem.Soc. 26, 209 (1901);                            c) 36, 208 (1906); d) 42, 1 (1909).
35.	Hydrochloride oder -bromide.
36.	Durch Variation im Ausgangsphenol.
37.	Die des O-Aryl-Produkts: E. Grigat u. R. Pütter, Chem. Ber. 107, 907-914 (1964).
38.	T.Höppner und H.G. Schweim, Arch. Pharm. 326, 493-495 (1993). Hydrochloride der N,N-Diarylamine mit Phenylcyanat in abs. Dioxan supendieren, Salz in Lösung, Umsetzung, Ausfall Salz des Isoharnstoff.
39.	Gleichartige Produkte traten nur mit aminhomologer Verbindungen (N,N-Dipropyl- und N,N-Dibutyl-O-phenyl-isoharnstoffen bei gleicher O-Phenylsubstitution mit Phenylisocyanat) auf.
40.	Versuche entsprechende Produkte bei Isoharnstoffen mit ver änderter Phenolkomponente, bei anderer Temperatur oder mit einem anderen Isocyanat zu erzielen, führten stets nur zu Carbamoylisoharnstoffen.
41.	R-Wert = 5,6 %.
42.	1) 190 K = 3,36 und 3,40 ppm 2) 250 K = 3,36 und 3,41 ppm und bewgl. Prot. bei 6,70 (N=H) 3) 270 K = 3,40 und 3,44 ppm und bewgl. Prot. bei 6,88 (N=H) 4) 290 K = 3,40 und 3,40 ppm
43.	Aus N,N-Diethyl-2-chloroform-amidin mit Na-phenolat bei 0oC in Dioxan.
44.	P.A. Argabright u. B.L.Phillips, Tetrahedron Lett. 48, 5033 (1968).
45.	Begrenzt vergleichbare Reaktionen sind in der Literatur beschrieben worden: a) E. Schaumann et. alt. Chem. Ber. 120, 339 (1987).     Umsetzung von Tosylisocyanat mit persubstituierten Isoharnstoffen über Vier-Ring. b) P.A.Argabright u. B. Phillips, Tetrahedron Lett. 48,5033 (1969).     Hier reagiert das Cyanatanion mit Isocyanat bei 75oC in DMF über die nicht isolierte Zwischenstufe des Phenylcarbamoyliso cyanations zum     entsprechendem 1,3-disubstituierten, nicht zum trisubstituierten Triazin. Diese bildet sich hingegen ohne Kaliumcyanatzusatz.
46.	Umsetzung von Phenylharnstoff mit 4-Nitrophenylchloroformi at zu N-Phenylallophansäure-nitrophenylester, Zugabe des Isoharnstoff, Abspaltung von Nitrophenol zum 2-Phenylisotriuret.
47.	L. Butula, Pharmazie, 33, 430 (1978).
48.	Zur Durchführung läßt man 20 - 30 Samen der Gartenkresse in destilliertem Wasser auf Filtrierpapier keimen. In der Originalvorschrift nicht erwähnt, aber besonders bemerkenswert erscheint mir, daß man unbehandelte Samen verwendet, die schwer zu bekommen sind. Nach 48 h Kultur bei 20 +/-10C wurde das Wasser gegen die Prüflösung ausgetauscht. Als Testkonzentration wurde 1 mg/ml verwendet. Nach 24 h bestimmten wir von der Hälfte der Samen, nach weiteren 24 h von der anderen Hälfte die Entwicklung der Wurzelhaare, indem wir sie unter einem Stereomikroskop betrachteten, photographierten und vermaßen und mit in Wasser gezogenen Samen verglichen.
49.	Die Acylcarbamoylisoharnstoffe riefen eine drastische Hemmung des Wurzelhaarwachstum, zum Teil der gesammten Wurzel, hervor, so daß aufgrund unserer bisherigen Erfahrungen eine mutagene Wirkung zu vermuten ist. Wir schließen dies aus Vergleichuntersuchungen mit als Arzneistoffen bekannten Zytostatika und Mutagenen Chemikalien, die wir durchgeführt haben.
50.	H.G.Schweim und K.Nagel, "Einfache Testsysteme zur Ermittlung der biologischen Wirkung von neuen Syntheseprodukten", Posterbeitrag zur 9. Wiss. Tagung der Österreichischen Pharm. Gesellschaft vom 28. - 30.04.1991 in Innsbruck. Sci. Pharm. 59, 64 (1991).
51.	D.B. Ludum, W.P. Tong, "DNA modifikation by nitroso-ureas", in: Cancer Chemotherapy Vol. II, Boston 1985, pp 141-154.
52.	T.Nakajima, M. Watanabe, K. Yokoyama, N. Yamada, S. Tuskagoshi und T. Taguchi, "A novel antitumor agent", in : Drugs of the future 13, 822 (1988).

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